1.2.3.2. Принцип постановки конкурентного метода ИФА
При конкурентном методе ИФА в лунки планшета с нанесенным антигеном одновременно вносятся исследуемые сыворотки и конъюгат. Конъюгат в данном случае - это антитела против ВИЧ, меченые ферментом. При последующей инкубации антитела, содержащиеся в сыворотке, и конъюгат вступают в конкурентное взаимодействие с иммобилизованными на твердом носителе антигеном. Если сыворотка содержит антитела, они взаимодействуют с антигеном, блокируя образование комплекса антиген-коньюгат. При отсутствии антител в сыворотке происходит образование комплекса антиген-коньюгат. Оставшиеся несвязанными компоненты после инкубации отмываются и в систему добавляется соответствующий субстрат. При наличии антител в сыворотке цветная реакция не развивается.
Таблица 1. Возможные ошибки при проведении ИФА
1. Типы дефекта
|
2. Видимые проявления
|
3. Возможные причины дефекта
| 1. Высокий фон | Значение оптической плотности в лунках с отрицательными сыворотками превышает 0,2 ед. | - неправильно приготовлено
разведение сывороток;
- неправильно проводилась
отмывка планшетов;
- неправильно приготовлен
коньюгат;
- неправильно приготовлен
субстрат;
- краситель плохого качества
(раствор красителя имеет
желтый цвет), заводской
брак
| 2а. Слабый сигнал | Значение оптической плотности положительного контроля ниже минимального значения оптической плотности указанного в инструкции, значение оптической плотности положительных сывороток не превышает 0,4 | - несоблюдение правил хранения тест-систем, что приводит к нарушению связи антигена с носителем;
- неправильное разведение контрольных и испытуемых сывороток;
- неправильное разведение и хранение перекиси водорода;
- заводской брак при изготовлении тест-системы4
| 2б. Слабый сигнал положительного контроля | Значение оптической плотности положительного контроля не превышает 0,4 ед. | - неправильное разведение и хранение разведенных контрольных сывороток;
- заводской брак
при изготовлении
контрольной сыворотки
| 3. Отсутствие сигнала | В лунках с позитивным контролем и позитивными сыворотками не произошло окрашивание | - не внесен коньюгат, неправильно приготовлен субстрат (не добавлена перекись водорода);
- не внесен антиген в лунки при изготовлении тест-системы
|
При постановке ИФА в случае получения положительного результата анализ проводится еще 2 раза (с той же сывороткой). При получении хотя бы еще одного положительного результата сыворотка направляется в референс-лабораторию.
1.2.3.3. Иммунный блотинг
В настоящее время для подтверждения специфичности первичного положительного результата чаще всего используется метод иммунного блотинга - Westen blot. Принцип метода заключается в выявлении антител к определенным белкам вируса, иммобилизованным на нитроцеллюлозную мембрану. В организме человека образуются антитела к ряду компонентов вируса, данные об этих антигенах приводятся в таблице.
Таблица 2
Группа белков
|
ВИЧ-1
|
ВИЧ-2
|
Белки оболочки вируса (env)
|
гп 160 кд, 120 кд, 41 кд
|
гп 140 кд, 105 кд, З6 кд
|
Белки сердцевины (gag)
|
п 55 кд, 24 кд, 17 кд
|
п 56 кд, 26 кд, 18 кд
|
Ферменты вируса (pol)
|
п 66 кд, 51 кд, 31 кд
|
П 68 кд
|
Примечание: молекулярный вес белков выражается в килодальтонах - кд, гп - гликопротеины, п - протеины.
Подготовка нитроцеллюлозных мембран для тест-системы производится следующим образом. На первом этапе производят разделение белков вируса иммунодефицита человека по молекулярному весу с помощью электорфореза в полиакриламидном геле. Белки мигрируют в слоях геля при наложении электрического потенциала: белки с низким молекулярным весом проходят через поры в полиакриламидном геле легче, чем белки с высоким молекулярным весом и быстрее достигают конца геля. В результате этого происходит разделение белков на отдельные полосы по молекулярному весу. Затем осуществляется электрофоретический перенос из полиакриламидного геля на поверхность нитроцеллюлозной мембраны. После этого мембрана обрабатывается блокирующим раствором во избежание неспецифического связывания иммуноглобулинов сыворотки крови, затем отмывается, высушивается и разрезается на отдельные полоски, которые вкладываются в набор. Перенесенные таким образом белки выявляются на нитроцеллюлозной реплике (блоте) с помощью непрямого анализа, а именно: сыворотка или плазма инкубируются с блотом: если исследуемый материал содержит антитела к белкам ВИЧ, они связываются с антигеном, перенесенным на нитроцеллюлозную мембрану, после отмывки полоски блота инкубируются с конъюгатом: при образовании комплекса антиген-антитело, конъюгат присоединяется к нему, после отмывки от конъюгата и инкубации с субстратом происходит окрашивание тех участков нитроцеллюлозы, где произошло образование комплекса антиген-антитело-коьюгат. Полученный результат сравнивается с результатами тестирования положительной и отрицательной контрольных сывороток.
Результаты, полученные в иммунном блоттинге интерпретируются как положительные, сомнительные и отрицательные.
|
