1.2. Лабораторные критерии для постановки диагноза ВИЧ-инфекции
Основным методом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к вирусу с помощью иммуноферментного анализа. Антитела к ВИЧ появляются у 90-95% зараженных в течение 3-х месяцев после заражения, у 5-9% - через 6 месяцев от момента заражения и у 0,5-1% - в более поздние сроки. Наиболее ранний срок обнаружения антител - 2 недели от момента заражения. В терминальной фазе СПИД количество антител может значительно снижаться, вплоть до полного их исчезновения. Серологическая диагностика инфекции ВИЧ на первом этапе строится на выявлении суммарного спектра антител против антигенов ВИЧ с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. На втором этапе методом иммунного блотинга (Western blot) проводится определение антител к отдельным белкам вируса.
1.2.1. Забор материалов, транспортировка и хранение сывороток крови
Забор крови производится из локтевой вены в чистую сухую пробирку в количестве 3-5 мл. У новорожденных можно брать пуповинную кровь. Полученный материал не рекомендуется хранить более 12 часов при комнатной температуре и более 1 суток в холодильнике при +4-8 С. Наступающий гемолиз может повлиять на результаты анализа. Лучше всего сразу после взятия крови отобрать из нее сыворотку. Сыворотка отделяется центрифугированием или обводкой крови по стенке пробирки пастеровской пипеткой, либо стеклянной палочкой. Отделенная сыворотка переносится в чистую (лучше стерильную) пробирку, флакон или пластиковый контейнер, и в таком виде она может хранится до 7 дней при температуре +4-8 С.
При работе следует соблюдать правила техники безопасности, приведенные в "Инструкции по противоэпидемическому режиму в лабораториях диагностики СПИД" N 42-28/38-90 от 5 июля 1990 года.
1.2.2. Оборудование, необходимое для проведения иммуноферментного анализа
Для проведения лабораторных исследований с помощью ферментных методов необходимо иметь следующее оборудование:
1. спектрофотометр;
2. отмыватель планшетов;
3. термостат;
4. автоматические пипетки;
5. наконечники к автоматическим пипеткам;
6. центрифуги;
7. холодильники;
8. тест-системы.
В настоящее время в России рекомендовано к применению достаточное количество тест-систем для выявления антител ВИЧ. Все они основаны на общем принципе иммуноферментного анализа.
Нагрузка на бригаду ИФА-диагностики должна оставлять до 400 исследований в смену, при условии оснащения современным автоматическим оборудованием и до 180-200 исследований, оснащенных отечественным рутинным оборудованием.
1.2.3. Иммуноферментный анализ
Принцип иммуноферментного анализа основан на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью фермента (пероксидаза, щелочная фасфотаза и др.) по изменению окраски специфического субстрата. Основной компонент твердофазных иммуноферментных тест-систем - полистироловый планшет с лунками или полистироловые шарики, на поверхности которых сорбирован антиген: вирусный лизат, рекомбинантные белки или синтетические антигенные детерминанты. Из всех модификаций твердофазного ИФА для диагностики инфекции, вызываемой ВИЧ, наиболее широко применяются непрямой и конкурентный варианты.
1.2.3.1. Принципы постановки непрямого метода ИФА
Предварительно приготовленный согласно инструкции, прилагаемой к набору, исследуемый материал (сыворотка, плазма) вносится в лунку планшета. Если этого требует методика, планшет предварительно отмывается. Несколько лунок планшета заполняются контрольными сыворотками, содержащими и не содержащими антитела к ВИЧ. При работе с контрольными сыворотками необходимо строго соблюдать инструкции по применению диагностической тест-системы, т.к. интерпретация результатов зависит от значений оптической плотности контрольных сывороток. Планшет с внесенными контрольными сыворотками и исследуемым материалом инкубируется при условиях, указанных в инструкции, прилагаемой к диагностическому набору. Если специфические антитела присутствуют в сыворотке, они образуют комплекс с антигеном, сортированным на поверхности лунок планшета. Несвязавшиеся с антигеном антитела удаляются при отмывке планшета.
Затем во все лунки планшета вносят конъюгат-антитела против иммуноглобулинов человека, меченые ферментом (пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.). При последующей инкубации происходит образование комплекса антиген-антитело-конъюгат. Несвязавшийся конъюгат удаляется во время отмывки планшета. Наиболее широко применяемым индикаторным ферментом для ИФА является пероксидаза хрена. Субстратом для нее является перекись водорода.
Эта реакция протекает без видимых проявлений. Изменение окраски раствора происходит при окислении красителей (ортофенилендиамина или др.), который входит в состав субстратного раствора.
Краситель из восстановленной формы переходит в окисленную окрашенную форму. Таким образом, происходит окрашивание только тех лунок, в которых присутствует комплекс антиген-антитело-конъюгат. Иногда окрашивание может быть результатом неспецифического связывания иммуноглобулинов с антигенами ВИЧ. Учет реакции проводят на спектрофотометре (ридере) при длине волны, указанной в инструкции, прилагаемой к диагностическому набору. Длина волны зависит от красителя, используемого в тест-системе.
|
